BL21感受态细胞制备：别再拿转化效率当玄学了！

开篇警告：别把感受态当成你随便糊弄的对象

我说各位，别一看到感受态制备就觉得“这玩意儿简单，随便搞搞就行”。呵呵，我告诉你，门槛是低，但真要做出高效率的感受态，那可不是闹着玩的。转化效率低了，你怪谁？怪质粒？怪培养基？到头来还不是怪自己没把细节做好？如果你连最基本的规范操作都懒得遵守，那我劝你还是直接购买商业感受态细胞，省时省力，还省得浪费我的时间看你那惨不忍睹的实验结果。

1. 菌种选择与培养：好的开始是成功的一半，但你确定你的“开始”没问题？

1.1 为什么选择BL21？

选择BL21菌株可不是随便拍脑袋决定的。BL21 (DE3) 菌株是蛋白表达的常用宿主菌，由于其 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷，能有效减少重组蛋白的降解，提高蛋白表达量。DE3 意味着染色体上整合了 lacUV5 promoter 控制下的 T7 RNA 聚合酶基因，可以通过 IPTG 诱导目的基因的表达。当然，如果你要表达的蛋白对宿主菌有毒性，可以考虑使用BL21-Star (DE3)菌株，它具有RNase E缺陷，能提高mRNA的稳定性，从而提高蛋白表达量。

1.2 预培养：别再过夜培养了！

很多人做感受态，第一步就错得离谱。预培养条件直接决定了感受态细胞的活力。最佳的预培养条件如下：

• 培养基成分： LB 培养基，具体配方：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl。必须使用新鲜配制的培养基！别用那种放了几个月的“老汤”，营养都流失了，细菌还怎么好好生长？判断培养基是否新鲜，最简单的方法就是看颜色，新鲜的LB培养基应该是淡黄色，如果颜色发暗或者出现沉淀，那就说明培养基已经变质了。
• 培养温度： 37.0 ± 0.1 ℃。温度控制非常重要，温度过高或过低都会影响细菌的生长状态。
• 摇床转速： 200 rpm。保证培养液中有足够的氧气。
• OD600值： 0.4-0.6。这是最重要的！绝对不能过夜培养！OD600值过高，细菌进入稳定期，细胞壁变厚，不利于后续的氯化钙处理。我再强调一遍，OD600值一定要控制在0.4-0.6之间！可以用分光光度计检测，如果手头没有分光光度计，可以目测，培养液呈现轻微的浑浊即可。

1.3 菌种筛选：别让“坏种子”毁了你的实验

不同批次的菌种活力可能存在差异，甚至可能受到污染。为了避免这种情况，建议在制备感受态之前，先进行简单的平板划线法筛选：

1. 取少量菌种，用无菌接种环在LB固体培养基平板上进行划线。
2. 37℃培养12-16小时。
3. 观察菌落形态。正常的菌落应该是圆形、光滑、边缘整齐。如果出现不同形态的菌落，或者菌落表面粗糙、边缘不规则，那就说明菌种可能受到了污染，必须更换新的菌种。

2. 氯化钙处理：细节决定成败，你的“差不多”只会导致失败

2.1 氯化钙的作用机制

氯化钙在感受态制备中的作用是中和细胞膜上的负电荷，使细胞膜更加稳定，并促进质粒DNA与细胞膜的结合。此外，氯化钙还能增加细胞膜的通透性，有利于质粒DNA进入细胞。不同浓度的氯化钙对细胞膜通透性的影响不同，过高或过低的浓度都会降低转化效率。

2.2 氯化钙溶液的配制

• 试剂等级： 必须使用分析纯（AR）级别的氯化钙！别用那些工业级的，杂质太多，会影响实验结果。
• 超纯水： 必须使用电阻率大于18 MΩ·cm的超纯水！自来水？蒸馏水？你想都别想！
• 配制方法： 准确称取一定量的氯化钙，用超纯水溶解，配制成100 mM的氯化钙溶液。用0.22 μm的滤膜过滤除菌。必须现配现用！放久了的氯化钙溶液可能会有杂质析出，影响实验结果。

2.3 冰浴、离心和洗涤：低温是关键，别让细胞膜“受伤”

• 冰浴时间： 细胞悬液在氯化钙溶液中冰浴30分钟。冰浴时间过短，细胞膜的通透性不够，转化效率会降低；冰浴时间过长，细胞活力会下降。
• 离心转速和温度： 离心转速控制在4000 rpm，温度控制在4.0 ± 0.1℃。离心转速过高或温度过高都会导致细胞膜损伤，降低转化效率。
• 洗涤次数： 用100 mM的氯化钙溶液洗涤细胞2次。洗涤的目的是去除培养基中的杂质，提高转化效率。

2.4 无菌操作：别让RNA酶污染毁了你的一切

分装感受态细胞时，必须在超净工作台中进行无菌操作。使用的离心管、枪头等耗材必须经过高压灭菌。操作过程中要戴手套，避免污染。特别要注意的是，要避免引入RNA酶污染！RNA酶会降解质粒DNA，导致转化失败。

如何检测是否存在RNA酶污染？很简单，取少量感受态细胞，加入RNA酶抑制剂，然后提取质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。如果质粒DNA出现降解，那就说明感受态细胞受到了RNA酶污染。

3. 感受态细胞储存：液氮速冻是王道，别再用“祖传”冰箱了

3.1 甘油的保护机制

甘油是一种常用的冷冻保护剂，它能降低细胞内冰晶的形成，减少细胞膜的损伤。最佳的甘油终浓度为15%。

3.2 快速冷冻：液氮，液氮，还是液氮！

必须使用液氮速冻！将分装好的感受态细胞迅速放入液氮中，使其在短时间内降至-196℃。速冻的目的是最大限度地减少冰晶的形成，保护细胞膜的完整性。如果你没有液氮，那我也没什么好说的了，转化效率低是必然的。

3.3 储存温度：-80℃只是下限，-150℃才是理想选择

感受态细胞必须储存在-80℃以下的低温冰箱中。-80℃只是下限！如果你有条件，最好使用-150℃的超低温冰箱，这样可以最大限度地延长感受态细胞的保存时间。储存温度越高，感受态细胞的活力下降越快。

3.4 禁止反复冻融：细胞膜的噩梦

绝对禁止反复冻融！每一次冻融都会对细胞膜造成损伤，降低转化效率。使用感受态细胞时，从冰箱中取出后立即使用，用不完的部分直接丢弃，不要再放回冰箱。

4. 转化操作：细节决定成败，再来一遍

4.1 质粒DNA的质量和浓度

质粒DNA的质量和浓度直接影响转化效率。必须使用高质量的质粒DNA，并控制在合适的浓度范围内。质粒DNA的质量检测方法有以下几种：

• 琼脂糖凝胶电泳： 观察质粒DNA的条带是否清晰、完整，是否存在降解。
• 分光光度计检测： 检测质粒DNA的A260/A280比值，该值应在1.8-2.0之间。如果A260/A280比值过低，说明质粒DNA中可能存在蛋白质污染。
• Nanodrop检测： Nanodrop是一种高通量的核酸定量仪，可以快速准确地检测质粒DNA的浓度和纯度。

4.2 热激温度和时间

热激温度必须精确控制在42.0 ± 0.5℃，热激时间控制在30-60秒。温度过高或时间过长都会导致细胞死亡，降低转化效率；温度过低或时间过短则无法使质粒DNA进入细胞。

4.3 复苏培养基、温度和时间

复苏过程中，建议使用不含抗生素的SOC培养基或LB培养基。复苏温度控制在37℃，复苏时间控制在1小时。复苏的目的是让进入细胞的质粒DNA复制并表达抗生素抗性基因。

4.4 涂板和培养箱温度

涂板时要均匀，避免出现局部菌液堆积。培养箱温度控制在37.0 ± 0.2℃。温度过高或过低都会影响菌落的生长。

5. 故障排除：别慌，问题总有解决办法

高级技巧：

• 使用DMSO提高转化效率： 在感受态细胞中加入5%的DMSO，可以提高转化效率。DMSO能增加细胞膜的通透性，有利于质粒DNA进入细胞。
• 使用电转方法制备高效率感受态细胞： 电转方法比氯化钙法制备的感受态细胞效率更高。电转的原理是利用高压电场在细胞膜上形成瞬时孔道，使质粒DNA进入细胞。

6. 实验记录规范：数据是最好的证明

详细记录实验过程是科研的基本素养。实验记录应包括以下内容：

• 日期： 记录实验的日期。
• 操作者姓名： 记录操作者的姓名。
• 菌种来源： 记录菌种的名称、批号和来源。
• 培养条件： 记录培养基成分、培养温度、摇床转速和OD600值。
• 氯化钙浓度： 记录氯化钙溶液的浓度。
• 冰浴时间： 记录冰浴时间。
• 离心转速和温度： 记录离心转速和温度。
• 储存温度： 记录储存温度。
• 转化操作： 记录热激温度和时间、复苏培养基、复苏温度和时间、涂板量、培养箱温度和培养时间。
• 试剂批号： 记录所有试剂的批号
• 转化效率： 记录最终的转化效率（CFU/μg DNA）。

实验记录表格模板：

最后，希望各位都能做出高效率的感受态细胞。记住，转化效率不是玄学，而是严格控制变量的结果。别再抱着“差不多就行”的心态了，认真对待每一个细节，你才能得到你想要的结果。2026年了，该卷起来了！